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一种可用于RealTime-PCR扩增链霉菌DNA的特异性引物制作方法

  • 专利名称

    一种可用于RealTime-PCR扩增链霉菌DNA的特异性引物制作方法

  • 发明者

    李顺鹏, 郑婕, 陈俊辉

  • 公开日

    2012年4月4日

  • 申请日期

    2011年12月6日

  • 优先权日

    2011年12月6日

  • 申请人

    南京农业大学

  • 文档编号

    C12Q1/68GK102399895SQ201110400009

  • 权利要求

    1.一种用于扩增链霉菌属细菌DNA的特异性引物,其特征在于其正向引物SF序列如 SEQ ID No. 1所示,反向引物SR序列如SEQ ID No. 2所示2.权利要求1所述的用于扩增链霉菌属细菌DNA的特异性引物在链霉菌的分子检测中的应用3.权利要求1所述的用于扩增链霉菌属细菌DNA的特异性引物在制备链霉菌检测试剂盒中的应用

  • 技术领域

    本发明属于生物检测领域,涉及一种可用于Real Time-PCR扩增链霉菌DNA的特异性引物

  • 背景技术

  • 具体实施例方式

    实施例1分别以的链霉菌(Sti^ptomyces ATCC 13273)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis, ATCC 6633)、鞘脂单胞菌(Sphingomonadales,ATCC 27551)、红球菌 (Rhodococcus, ATCC6939)、伯克氏菌(Burkholderia,ATCC 17616) 5 个属细菌 DNA 为模板进行引物VF/VR的特异性验证试验菌种购自ATCC(American Type Culture Collection).PCR扩增体系为25 μ L由0. 5 μ L DNA模板(约IOng)、0. 5 μ L正向引物 SF(10yM)、0.5yL 反向引物 SR(10 μ Μ)、0· 5 μ L dNTPs (10mmol/L)、2· 5 μ L IOXPCR buffer (with MgC12) ,0. 2μ 1 TaqDNA 聚合酶(5U/μ L),灭菌双蒸水补足 25 μ LPCR 扩增反应条件为预变性95°C 5min,变性94°C 30s,退火59°C 30s,延伸72°C 45s,共35个循环, 72°C 延伸 5min,4°C 保存将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如图1所示,从图1中可以看出本实施方式用于扩增链霉菌的特异性引物SF/SR能够准确的扩增出链霉菌的靶标序列片段,而未能从其他属细菌DNA和空白对照中扩增出核酸片段将1号泳道对应的序列片段于T载体连接后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞测序,测序结果为序列长度为200bp,并且经blast分析,为链霉菌(Sti^ptomyces)的特异序列可见该特异引物SF/ SR能够用于链霉菌的分子鉴定实施例2用OMEGA公司的Soil DNA Kit提取土样采自河北廊坊市和湖北武汉市)土壤DNA, 应用引物SF/SR对8份提取的土壤DNA进行PCR扩增试验PCR扩增体系为25 μ L由1 μ L DNA模板(约IOng)、lyL正向引物SF(10y Μ)、lyL反向引物SR(10y Μ)、12. 5 μ L,灭菌双蒸水补足25 μ L0 PCR扩增反应条件为预变性95°C 3min,变性94°C 30s,退火59°C 30s,延伸72°C 4 ,共35个循环,72°C延伸5min,4°C保存将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如图2所示,从图2中可以看出本实验用于扩增链霉菌的特异性引物SF/SR能够准确的扩增出所有土壤样品DNA中的链霉菌的靶标序列片段挑选1 8号泳道对应的序列片段分别于T载体连接后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞测序,测序结果为序列长度为200bp,并且经blast分析,为链霉菌(Sti^ptomyces)的特异序列

专利详情

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权利要求

说明书

法律状态

专利名称:一种可用于Real Time-PCR扩增链霉菌DNA的特异性引物的制作方法链霉菌(Sti^ptomyces)是一种地理分布和寄主范围均很广泛的放线菌,主要在土壤和腐败的植物中发现,大部分链霉菌会产生孢子,是重要的腐生物,并且会使土壤产生土腥味。链霉菌属于ActincAacteria,大概550种链霉菌已经被发现,并且不断有新种被发现。链霉菌家族对人类的一个重要贡献就是产生各种抗生素。链霉素、四环素、和红霉素等都是由它们产生的。链霉菌在土壤中可以忍受极端的环境。科学家从测出的基因组序列中发现,链霉菌拥有大量基因以适应不同的环境,其中大约12%的基因是负责打开或者关闭其他基因。抗生素的滥用给细菌施加了强大的自然选择压力,测定链霉菌的基因组可以帮助制造更有效的抗生素,在某种程度上克服细菌的抗药性。只有少部分的链霉菌是病原体,主要是植物病原体,感染植物根系,例如 Streptomyces caviscabies, Streptomyces acidiscabies,也会使马铃薯得马铃薯疫痂病。Streptomyces somaliensis 禾口 Streptomyces sudanensis 感染人体后会得足分支菌病。目前,扩增链霉菌的特异引物扩增的片段大多为500bp或者更大,不利于应用到 Real Time-PCR定量的检测样品中的链霉菌。对于分布广泛和功能强大的链霉菌,如果能设计特异性的引物,运用Real Time-PCR技术定量检测样品中链霉菌的丰度,对于实验室研究和实际应用,有很大的意义。
本发明是为了解决目前缺乏弓丨物从样品DNA中以Real Time PCR扩增出链霉菌靶标序列的问题,而提供一种用于扩增链霉菌的特异性引物。一种用于扩增链霉菌属细菌DNA的特异性引物,其正向引物SF序列如SEQ IDNo. 1 所示,反向引物SR序列如SEQ ID No. 2所示。所述的用于扩增链霉菌属细菌DNA的特异性引物在链霉菌的分子检测中的应用。所述的用于扩增链霉菌属细菌DNA的特异性引物在制备链霉菌检测试剂盒中的应用。有益效果本发明的引物是根据链霉菌核糖体rDNA的序列碱基存在差异和Real Time-PCR的引物要求设计的。应用本发明的引物SF/SR可从各类含有链霉菌的样品DNA中直接快速扩增出长度为200bp的链霉菌目的片段。可以应用于Real Time-PCR,可以快速定量检验土壤中链霉菌。图1为实施例1中SF/SR引物对5种属细菌DNA扩增产物的凝胶电泳图。M泳道为标准BM2000,1号泳道为含有链霉菌(Sti^ptomyces)菌株DNA的扩增结果,2-5号泳道分别为含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,)、鞘脂单胞菌(Sphingomonadales)、红球菌 (Rhodococcus,)、伯克氏菌(BurWiolderia,)DNA的扩增结果,6号泳道为不含DNA空白对照的扩增结果。图2为实施例2中SF/SR弓丨物对土壤样品DNA扩增产物的凝胶电泳图。M泳道为标准DL2000,1-4号泳道分别为河北廊坊市土壤样品DNA的扩增结果,5-8号泳道分别为湖北武汉市土壤样品DNA的扩增结果。


本发明属于生物检测领域,涉及一种可用于Real Time-PCR扩增链霉菌DNA的特异性引物。该扩增链霉菌DNA的特异性引物其正向引物SF序列如SEQ IDNo.1所示,反向引物SR序列如SEQ ID No.2所示。本发明的引物是根据链霉菌核糖体rDNA的序列碱基存在差异和Real Time-PCR的引物要求设计的。应用本发明的引物SF/SR可从各类含有链霉菌的样品DNA中直接快速扩增出长度为200bp的链霉菌目的片段。可以应用于Real Time-PCR,可以快速定量检验土壤中链霉菌。



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