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分离的激动剂型抗edar单克隆抗体的制备制作方法

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    分离的激动剂型抗edar单克隆抗体的制备制作方法

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    本发明涉及本质上纯化的激动剂型抗EDAR单克隆抗体,或分离的单克隆抗体片段,或抗原结合部分或其片段的制备本发明进一步涉及分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体,或分离的单克隆抗体片段,或抗原结合部分或其片段,以及它们在治疗χ-连锁少汗型外胚层发育不良和牙齿发育不全中的用途本发明也涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体,或分离的单克隆抗体片段,或抗原结合部分或其片段,本发明还涉及一种治疗X-连锁少汗型外胚层发育不良和牙齿发育不全的方法最后,本发明涉及一种药物试剂盒,所述药物试剂盒包括所述分离的激动剂型抗EDAR 单克隆抗体,或分离的单克隆抗体片段,或抗原结合部分或其片段

  • 背景技术

  • 具体实施例方式

    本文所使用的下列定义是为了便于理解本发明“一种㈧”或“一种(an) ”是指“至少一种”或“一种或多种”术语“包含(comprise) ”通常用于表示含有(include)的意思,即允许一个或多个特征或组分的存在本文所使用的术语“蛋白质”、“多肽”、“多肽的”、“肽”和“肽的”或“肽链”在本文

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专利名称:分离的激动剂型抗edar单克隆抗体的制备的制作方法外胚层发育不良(ectodermal dysplasias, EDs)是先天性的,弥漫性的 (diffuse)和非进行性的。EDs包括一大类异质的遗传病症,这些病症在源自胚胎外胚层的2种或更多种组织的发育过程中均存在原发性缺陷(primary defects)。迄今为止,已经记载了超过192种的不同病症。最常见的EDs是X-连锁少汗型外胚层发育不良 (Christ-Siemens-Touraine综合征)和有汗型外胚层发育不良(Clouston综合征)。X-连锁少汗型外胚层发育不良也被公认为XLHED,下文中也将其称为XLHED。主要涉及的组织为皮肤、毛发、指甲、外分泌腺和牙齿。可以观察到毛囊数目的减少以及结构性毛干的异常(abnormality)。结构性毛干的异常可能由毛球形成中的畸变(aberration)造成,所述畸变包括纵行沟槽(longitudinal grooving)、毛干扭转(torsion)和表皮层皱褶(cuticle ruffling) 0毛球可能为扭曲的(distorted)、分叉的(bifid)和很小的。特别是在患有少汗型ED的患者中,外分泌汗腺可能缺失或为稀疏且退化 (rudimentary)的。可能发生唾液腺和泪腺的发育不完全(hypoplasia)。在一些患者中,上呼吸道及支气管、食道和十二指肠中粘液腺可能缺失。可能出现牙齿的异常形态发生或没有牙齿。异常的甲板(nail plate)形成可产生发脆(brittle)、变薄、起皱(ridged)或严重变形(deformed)的指甲。在较早的婴儿期O岁以前)中的死亡率接近30%。发病率和死亡率与外分泌腺和粘液腺的缺失或功能障碍有关。过了幼童时期,预期寿命的范围为从正常到略有缩短。已鉴定出一种为人和小鼠的外胚层衍生而来的若干器官的正常发育所需要的激活蛋白,即外异蛋白同种型Al(Eda-Al,下文称为EDAl)。该分子由外异蛋白基因(EDA)编码,属于肿瘤坏死因子家族。该外异蛋白基因编码2种蛋白同种型EDA1和EDA2,二者分别结合并激活两种不同的受体EDA1受体(EDAR)和X-连锁EDAl受体(XEDAR)。下文中将 EDAl受体称为EDAR。 XLHED的特征在于作为EDAR的配体的EDAl的缺失或功能缺乏。人们已经进行了研究以表征XLHED的起源并找到合适的治疗方法。其中的大部分研究已经在与人类XLHED患者共享多种症状的Tabby小鼠中完成。类似于人XLHED患者, Tabby小鼠的表型由位于X染色体上的EDA基因的突变造成。已经研究了多种治疗XLHED的方法。其中一种方法是利用含有与IgGl的Fc域的C端融合的Eda-Al的受体-结合域白勺Ι !蛋白。HjliJxiItl "Permanent correction of an inherited ectodermal dysplasia with recombinant EDA,,(0. Gaide 等,Nature Medicine, vol. 9, number 5, pp 614-618, 2003年5月)中记载了将重组EDAl给予发育中的胚胎和新生的Tabby小鼠,以用来矫正其表型并为XLHED的可能的治疗提供基础。在美国专利2005/152,872 (Gaide等人)中也记载了这一方法。特别地,该文件公开了包含含有以下的氨基酸序列的重组融合蛋白(a)作为组分(A)或组分(A)的功能性变体的免疫球蛋白的Fc区段或Fc区段的一部分;(b)作为组分(B)或组分(B)的功能性变体的TNF配体的胞外部分或TNF配体胞外部分的一部分序列;和任选的(c)组分(A)与组分(B)之间的过渡区,包含接头。US 6,355,782 (Zonana 等人)和 US 7,115,555 (Zonana 等人)中公开了另一种方法。在这些文件中记载了用于通过改变细胞或组织中的EDAl活性,增强或减弱起源于外胚层的细胞或组织(例如毛发、牙齿、皮肤,和/或汗腺)的发育的编码人EDAl的核酸序列以及方法和组合物。可单独使用本文公开的EDA1、dl和DL基因,cDNA和蛋白序列(及其变体、多态性和突变体),以及反义分子和特异结合试剂,或与药物载体联用来提高或降低 EDAl的活性。考虑到抗体是最广泛使用的治疗蛋白类型,再考虑到对于抗体的制造而言,显然已经很好地建立了安全性、长半衰期、良好的生物利用度、易于生产和可控的成本,US 2003/0023991 (Zonana等人)设想了这样一种方法。特别地,该文件记载了与外胚层发育不良有关的蛋白配体(EDAl-II)和受体(dl和DL)的DNA和氨基酸序列。也公开了变体的 DNA和氨基酸序列以及所述配体和受体的治疗性应用。同时记载了可使用针对EDAR(dl/ DL)的抗体进行给药的不同的潜在应用。该应用特别记载了针对dl/DL(EDAR受体)的拮抗剂的用途。根据这一应用,这些拮抗剂可用于减少毛发生长,例如用于治疗多毛症;抑制牙齿发育,例如异位牙;选择性地消除汗腺,例如上唇或腋下的汗腺;以及抑制乳腺上皮细胞增殖,例如治疗乳腺癌;或用于其他皮肤创伤中。最后,设想了单克隆或多克隆抗体的生产和使用。然而,该文件并没有记载激动剂型或拮抗剂型的抗EDAR抗体的具体序列。没有提供起作用的实例以证明单克隆抗体或多克隆抗体是具有生物学活性的、有效的和有功能的。也许可以说单克隆抗体的选择对本领域技术人员而言是一种常规的工作。然而,人们无法认同分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的制备和获取是常规技术且不具备创造性。例如,通过用FS-7人成纤维细胞膜免疫接种小鼠得到针对人!^s的CHll单克隆抗体,所述人Fas是TNF受体家族的另一个成员,(Yonehara等,1989,J. Exp. Med 169. 1747-1756)。CHll是一种IgM0当使用识别完全相同的表位的IgGl (mAbZB4)或使用 CHll 的二价 Fab,2 时,没有激动剂活性(Fadeel 等,1997 Jnt Immunol 9,201-209) 激动剂型抗人Fas单克隆抗体的第二个实例是AP0-1。通过用人SKW 6.4细胞系的质膜免疫接种小鼠得到抗人Fas单克隆抗体AP0-1 (Trauth等,1989,Science 245,301-305) 该抗体是一种IgG3。尽管该抗体的Fas结合部分保持不变,一旦进行同种型转换,该抗体便丧失其激动剂活性(Dhein等,1992,J. Immunol 149,3166-3173)。可尝试性地通过IgG3的自身聚合倾向解释该结果。这两个例子表明针对TNF受体家族成员的激动剂型单克隆抗体的获取对本领域技术人员来说决不是小事。在本发明的情况下,申请人必须面对如下的数个问题-商业化的抗EDAR多克隆抗体(在山羊中产生,来自R&DSystems)不能诱导转导了 EDAR:Fas的Jurkat细胞的死亡。人们可以认为所述多克隆抗体制剂是由具有各种活性 (激动剂、拮抗剂等)的抗体混合物制成。因此令申请人失望的是,观察到即使使用了大量的抗体,基于细胞进行的分析仍不显示任何激动剂活性。这些结果对激动剂型抗EDAR单克隆抗体的开发而言并不鼓舞人心。-依赖于EDAl的生物学分析的开发因为多个原因而困难重重。第一,仅有少数细胞系内源性地表达EDAR( —个实例是人角质化细胞系HaCat)。筛选了若干人类、小鼠和大鼠的角质化细胞系中EDAR表达的情况。所述筛选通过用Fc-EDAl和抗EDAR单克隆抗体对细胞染色,利用流式细胞术检测。没有细胞系表达可检出水平的EDAR。第二,发现依赖于 NF B的读出系统差强人意(I B的磷酸化和降解),因为它既不定量,也不可完全重现。为了克服这些局限性,最终尝试了向转染了 EDAR的成纤维细胞中导入由NF B启动子控制的报告基因(例如荧光素酶)。然而,还发现该系统不能得到恰当发挥作用的生物学活性分析 (低信噪比和低灵敏度)。因此,使用本领域技术人员已知的技术不能令人满意。-天然存在的可溶性EDAl蛋白可能为三聚物的多聚体(Swee等,J.Biol. Chem. 284 :27267_76,2009),并且Fc-EDAl为六聚体配体。由于!^as已得到了详尽的记载, 申请人:得到了表明多个EDAR受体的同时接合(engagement)和成簇(clustering)是生物学活性所必需的证据(Swee等,J. Biol. Chem. 284 :27267-76, 2009)。相反,抗EDAR抗体仅为二价。因此,这种分子形式不太可能与Fc-EDAl具有同样的生物学活性。-没有可用的合适的动物模型。没有合适的小鼠品系(EDAR缺乏的小鼠)的鉴别, 将会严重妨碍本发明抗体的开发。假定缺少申请人所推荐的动物模型和具体的准备过程, 将不能得到具有激动剂性质的抗EDAR单克隆抗体(即因为它们在EDAR上将具有不同的结合位点)。然而,需要针对XLHED的更有效的治疗方法并提高患有这类疾病的患者的生活质量。特别是目前没有可用于患有外胚层发育不良(如XLHED或牙齿发育不全)的儿童、青少年或成人的祛病(curative)疗法。本发明的目的在于提供用于制备本质上纯化的和分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的新工艺,所述抗体为有生物学活性的、有效的和有功能的。本发明也能够迅速地辨别最佳的激动剂型抗EDAR单克隆抗体。本发明也展示了激动剂型抗EDAR单克隆抗体作为候选药物用于治疗XLHED或相关疾病的用途。可从上文明显得到的这些目的和其他目的已经由本发明实现。 发明内容在第一个实施方式中,本发明涉及用于生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体,或分离的单克隆抗体片段,或抗原结合部分或其片段的方法,所述方法包括以下步骤a)生产小鼠和/或人和/或脊椎动物种的EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白;b)用所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白免疫接种EDAR缺乏的小鼠;c)检测免疫接种了所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的EDAR缺乏的小鼠的血清中的抗EDAR抗体;d)生产骨髓瘤细胞和来自免疫接种了 EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的EDAR缺乏的小鼠的淋巴结细胞间的杂交瘤;e)通过下述i.的方法鉴定识别人和/或小鼠EDAR和/或来自脊椎动物种的EDAR 的激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段在如下 .和iii.方面的能力i.利用经设计用于检测所述激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、 或者抗原结合部分或其片段与人和/或小鼠EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白之间的结合的结合分析;和ii.在表达EDAR或EDAR融合蛋白的细胞或组织中诱导体外生物学应答的能力;iii.在表达EDAR或EDAR融合蛋白的生物体中诱导体内生物学应答的能力;f)基于步骤e)ii和步骤e)iii,选择生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体的杂交瘤系;g)对上述选择的杂交瘤系进行克隆和亚克隆;h)对得到的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段进行纯化。在第二个实施方式中,本发明提供了由该工艺获得的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体或分离的单克隆抗体片段,或抗原结合部分或其片段,其中,对Fab片段而言,所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体或分离的单克隆抗体片段,或抗原结合部分或其片段以至少10_8M的亲和力(KD)结合至人和/或小鼠的EDAR。此外,如实施例7所记载的 当将所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体或分离的单克隆抗体片段,或抗原结合部分或其片段给药于新生Tabby小鼠时,其能以小于20mg/kg的EC50与小鼠EDAR交叉反应诱导尾部毛发形成和/或汗腺形成。本发明也公开了编码所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体或分离的单克隆抗体片段,或抗原结合部分或其片段的分离的核酸分子,还公开了包含至少一个拷贝的所述核酸分子的表达载体。本发明也公开了包含本发明的表达载体的宿主细胞;分泌所述分离的激动剂型抗 EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的杂交瘤;以及含有所述分离的核酸分子和/或所述表达载体的基因组的转基因非人动物。此外,本发明涉及包含本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段以及药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的又一目的涉及所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或所述药物组合物在制备用于调节外胚层起源的细胞或组织(例如毛发、牙齿、皮肤、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞(larynx and trachea mucus-producing cells)、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺)的发育的药物中的用途。本发明的另一目的包含所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或所述药物组合物在制造用于皮肤重建或改进毛发形态的药物中的用途。本发明也提供增强组织中一个或多个毛囊、牙齿、汗腺、皮脂腺、喉和气管产粘液细胞、睑板腺、包皮腺、乳腺和唾液腺发育的方法,该方法包括将本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或本发明所述的药物组合物给予有需要的受试者。最后,本发明涉及包含至少有效量的本发明所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段或本发明所述药物组合物的药物试剂盒及其使用说明书。通过阅读接下来的具体描述,并参考下列说明性附图和所附权利要求书,本发明的其他目的和优势对于本领域技术人员来说将是显而易见的。图1.通过蛋白G亲合色谱纯化的抗EDAR mAb的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。从无血清培养基(mAbEDARs,1-4、6-10、12-14)或含血清培养基 (mabEDAR5,ll和15)中的培养物上清中,通过蛋白G亲合色谱纯化抗EDAR mAb。利用对在还原条件下进行的SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色来分析纯化的材料(10 μ g/道)。分子量标准在最左边泳道跑电泳,它们的相应大小用kDa表示。结果显示该纯化的抗EDAR mAb具有典型的mAb的特征(它在蛋白G上纯化,并由预期的大小约为50kDa和25kDa的重链和轻链组成)。图2.抗EDAR mAb的非变性凝胶电泳。除了电泳时间为Ih外,按照制造商的说明, 通过非变性凝胶电泳(BIOMIDI,RefKGMP)和酰胺黑染色分析蛋白G纯化的4μ g的抗EDAR 抗体。结果显示不同的mAbEDARs具有不同的等电点。图 3.抗 EDAR 单克隆抗体 mAbEDARl、2、3、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14 和 15 的重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列的测定。序列起始于所述重链的成熟N端。以粗体和下划线标示⑶R。图 4.抗 EDAR 单克隆抗体 mAbEDARl、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14 和 15 的轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列的测定。序列起始于所述轻链的成熟N端。以粗体和下划线标示⑶R。图 5.抗 EDAR 单克隆抗体 mAbEDARl、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14 和 15 的
重链和轻链的氨基酸序列的比对。序列起始于成熟N端。CDRs用大方框突出显示。标示出了由V、D和J基因编码,或由随机添加的核苷酸(N)编码的蛋白质区段的假定接合区 (junction)。也显示了与恒定区(C)的接合区。mAbEDARs 1、2、3、4、5和6的重链和轻链经 SDS-PAGE分离,胰蛋白酶消化并由液相色谱质谱联用(LC-ms-ms)进行了分析。标示出了由 LC-ms-ms 鉴定的Jft。mAbEDARl、2、3、4、7、8、9、10、11、12、13、14 和 15 是 IgGl,mAbEDAR5 是IgG2b, mAbEDAR6 是 IgG2a。从此图中可以看出,虽然mAbEDAR2和mAbEDAR4的轻链相同,mAbEDARlO和 mAbEDARl 1 的重链相同,但 mabEDARl-15 都是不同的。mAbEDARl、mAbEDAR3 和 mAbEDAR8 具有类似的重链,该重链极可能来源于相同的Vh基因,并具有类似的轻链,该轻链极可能来源于相同的八基因。图6.抗EDAR mAb与小鼠EDAR和人EDAR的特异性结合。将梯度浓度的mAbEDARl_4 或对照 mAb (ApriIy 5)加入到用 100 μ 1 的 1 μ g/ml 的人 EDAR-Fc、小鼠 EDAR-Fc、人 Fas-Fc 或Flag-人APRIL包被的96孔ELISA板的孔中。通过加入偶联至HRP的抗小鼠IgG并随后加入底物来显示结合的抗体。于490nm下测定吸光度。该图显示了与人EDAR(图A)和小鼠EDAR(图B)都结合的四种抗EDAR mAb。此外,由它们不能与人i^as-Fc (图C)结合而确定了它们的结合特异性。不相干的同种型匹配的单克隆抗体(Aprily-5)能够识别APRIL,却不能识别任何一个EDAR-Fc分子(图D)。对用于实验的EDAR-Fc和Fas-Fc的样品(5g)进行非还原的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色(图 E)。图7.抗EDAR mAb在^festern印迹法中的用途。(A)纯化的人EDAR-Fc、小鼠 EDAR-Fc、人!^as-Fc (见图6E)和Flag-人Apr i 1在还原或非还原的条件下进行12 %的 SDS-PAGE,转移至硝化纤维素膜并用所示的mAbEDARl-4或Aprily5探测。结果显示抗EDAR mAb mAbEDARl、2、3和4能够识别固定在硝化纤维素膜上的人 EDAR和小鼠EDAR两者,但是只能在非还原的条件下识别,这表明完整的二硫键是EDAR识别所需要的。与小鼠EDAR得到的信号较弱可由凝胶上的小鼠EDAR-Fc上样量较少来解释。通过显示出没有一个mAbEDARs与Fas-Fc和Flag-人APRIL结合(而抗APRILmAb 识别Flag-人APRIL)确立其结合特异性。(B)牛血清白蛋白(BSA,2 μ g)、纯化的人 EDAR-Fc (20ng)和纯化的hFas_Fc (20ng),在还原或非还原的条件下进行12%的SDS-PAGE, 转移至硝化纤维素膜上并用mAbEDARl-15探测。在BSA泳道中mAbEDAR5识别的条带可能是由于相邻泳道EDAR-Fc的交叉污染。这些图显示出在非还原条件下,所有mAbEDARs特异性地识别人EDAR-Fc而不识别 Fas-Fc0这些图进一步显示出mAbEDAR5、6和12也能识别还原的EDAR。图 8.抗 EDAR mAb 不与 Fc-EDAl 竞争结合 EDAR(A、B、C)。如所示的,用 hEDAR-Fc 包被ELISA板的孔,用牛奶封闭,并用用作竞争剂的梯度浓度的mAbEDARl、2、3、4、Aprily5 或Fc-EDAl孵育。其后,如所示的,加入恒定量的生物素化的mAbEDARl、2、3或4(A),或带 Flag标签的EDAl (B)。用偶联有辣根过氧化物酶的链霉亲和素显示生物素化的mAbEDARs的结合,用生物素化的抗Flag抗体(IC)和偶联有辣根过氧化物酶的链霉亲和素显示Fc-EDAl 的结合。直接使用偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠抗体显示mAbEDARl、2、3和4的结合(C)。 加入底物后,在490nm下监测吸光度。此图显示抗EDAR mAb和Fc-EDAl之间不竞争结合EDAR,这意味着抗EDAR mAb和 Fc-EDAl与EDAR上的不同位点结合。该图也显示出mAbEDARl、2、3和4相互竞争结合EDAR, 而mAbEDARl具有最强的结合效力。图9通过ELISA完成的重组人EDAR上的抗EDAR单克隆抗体的表位定位(印itope mapping)。(A)人EDAR的线性示意图显示了半胱氨酸残基的位置(水平细线),推定的N-连接的糖基化位点的位置(水平粗线,N),组成三个富含半胱氨酸的域(CRD1、CRD2、CRD3)的六个结构模块的位置(圆角矩形),跨膜域的位置(矩形,TMD),信号肽的位置(前导区), 茎结构的位置和胞内域的位置(ID)。标明了感兴趣的接合区处的氨基酸数目。箭头表明预测的信号肽的切割位点。除胞内域外,该图是按比例绘制的。⑶用山羊抗人IgG抗体包被 ELISA板的孔,封闭,并进一步与经转染的细胞的细胞上清中的人EDAR-Fc、小鼠EDAR-Fc或所示的人EDAR-Fc截短蛋白孵育。留出一个无细胞上清的孔(对照,Ctrl)。使用偶联有辣根过氧化物酶的驴抗人IgG抗体控制各EDAR-Fc蛋白的有效捕获。用偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体监测mAbEDARs的结合。该图显示出mAbEDARl、2、3、4、7、8、10和11识别CRD1和CRD2中的表位(但是不能识别单独的CRDl或CRD2),mAbEDAR5、6、12和13识别全部包含在CRDl中的表位,mAbEDAR9、 14和15识别EDAR的全长胞外域,而不能识别含有两个相邻的CRDs的任意组合的融合蛋白。除mAbEDAR15仅能识别人EDAR而不能识别小鼠EDAR外,所有mAbEDARs都能识别人 EDAR和小鼠EDAR两者。图10通过Western印迹完成的重组人EDAR上的抗EDAR单克隆抗体的表位定位。 存在于经转染的细胞的上清中的所示的EDAR-Fc截短蛋白在非还原的条件下进行12%的 SDS-PAGE并转移至硝化纤维素膜。经不相干的乳蛋白饱和后,用1 μ g/ml的mAbEDARl、2、 3、4、5或6和随后的偶联有辣根过氧化物酶抗小鼠IgG抗体或偶联有辣根过氧化物酶抗人 IgG抗体使膜显示。分子量标准(以kDa表示)的位置标示在左边。此图显示EDAR-Fc截短突变体以大致相当的含量存在于所述膜上。mAbEDARl、2、3 和4识别与CRDl和CRD2重叠的表位,而mAbEDAR5和6识别全部包含在CRDl中的表位。图11通过FACS完成的抗EDAR单克隆抗体的表位定位。将编码融合至TRAIL-R3的 C端部分的人EDAR所示部分的质粒(包括其糖基化磷脂酰肌醇(GPI)-附加序列)与编码增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的示踪质粒一同转染至四31~细胞中。转染两天后,用mAbEDARl、 2、3或4及随后的偶联有PE的抗小鼠IgG抗体对细胞染色。还用识别TRAIL-R3的大鼠单克隆抗体mAb572及随后的偶联有PE的抗大鼠IgG抗体对细胞染色。使用双色FACS对细胞进行分析。在FLl上检测EGFP,并与GPI锚定的EDAR片段的表达关联。在FL2中检测抗体的结合。利用经转染的细胞(即FLl荧光强度为50-1000的细胞)的平均FL2荧光强度对抗体的结合进行定量。该图显示mAbEDARl、2、3和4识别与CRDl和CRD2重叠的人EDAR上的表位。该图也显示所述抗体可识别在细胞表面表达的天然EDAR-GPI蛋白。图12抗EDAR单克隆抗体对表达EDAR-Fas的Jurkat细胞的杀伤(A、B)。测试纯化的抗EDAR单克隆抗体mAbEDARl-mAbEDAR14和纯化的Fc-EDAl的连续稀释物诱导表达 mEDAR-Fas的、Fas-缺乏的Jurkat细胞(A)凋亡的能力或诱导表达hEDAR-Fas的、Fas-缺乏的细胞(B)凋亡的能力。过夜培养后,通过PMS/MTS染色测定细胞存活力。取决于抗体及细胞系,Fc-EDA的EC50(诱导细胞存活力半最大下降(half maximal decrease)的激动剂浓度)为约lng/ml,而mAbEDARl、3、8、10和12的EC50在5_500ng/ml之间。在该测试中,mAbEDAR2、4、5、6、7、9、ll、13和14没有或几乎没有活性。这些结果显示在体外细胞培养中,抗EDAR抗体中的一些而不是全部可通过 EDAR-Fas融合蛋白促进传导,但是它们不如Fc-EDAl有效。
图13抗EDAR多克隆抗体不能诱导杀伤表达EDAR-Fas的Jurkat细胞。在存在或不存在抗山羊IgG(A)和纯化的Fc-EDA(B)的条件下,测试山羊抗小鼠EDAR多克隆抗体的连续稀释物诱导表达EDAR-Fas的、Fas-缺乏的Jurkat细胞凋亡的能力。过夜培养后,通过PES/MTS染色测定细胞存活力。AP0200的EC50 (诱导细胞存活力半最大下降的激动剂浓度)在3-9ng/ml之间,而所述抗EDAR多克隆抗体不能诱导细胞死亡。这些结果显示所述抗小鼠EDAR多克隆抗体在体外没有激动剂活性。抗人EDAR多克隆抗体得到了类似的结果。总之,这些结果支持了对激动剂型抗EDAR单克隆抗体的开发并不是显而易见的的论点。图14注射入新生小鼠后能矫正Tabby表型的抗EDAR mAb的鉴定。将来自40个阳性杂交瘤的上清样品通过腹膜内注射给予一天龄的Tabby小鼠。6周以后,测定爪垫上的功能性汗腺以及尾部毛发的存在。示出了利用7种杂交瘤上清样品得到的结果的实例。这些结果显示超过一半的所述杂交瘤上清能够诱导爪垫上功能性汗腺的发育和尾部毛发的生长,这表明大部分的抗EDAR mAb具有模拟天然存在的蛋白EDAl的活性的激动剂性质。图15抗EDAR mAb在新生Tabby小鼠中的治疗剂量。在刚出生的的Mh内,经腹膜向新生Tabby小鼠注射梯度剂量的蛋白质G亲和色谱纯化的抗EDAR mAb。4至6周以后 OnAbEDARl、2、3和4)或3周以后(mAbEDAR4_14和Aprily5),给尾部的毛发密度打分(A)。 此外,对小鼠进行淀粉-碘汗水测试,给功能性汗腺的存在打分⑶。这些结果显示,在新生Tabby小鼠中,大部分mAbEDARs产生半最大效应的剂量在 0. 1-0. 5μ g的范围内,类似于用Fc-EDAl得到的结果。虽然体外效力比Fc-EDAl低10至 1000倍以上,但当用于体内时,抗EDAR mAb与Fc-EDAl同样有效。图16抗EDAR mAb在野生型小鼠中的半衰期。对野生型小鼠静脉内注射200 μ 1 的lmg/ml的mAbEDARl或mAbEDAR3。分别在20分钟、1天、2天、8天、16天和32天后收集血清样品。通过在用lPg/ml的人EDAR-Fc包被的孔中孵育血清的连续稀释物,随后加入偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG和OPD底物,测定抗EDAR mAb的浓度。为了分析,将在各个时间点显示OD = 1的血清稀释度(认为其代表IC5tl)绘制为时间的函数。除20分钟的时间点之外,在上述一系列点上拟合指数曲线。由此确定了 mAbEDARl和mAbEDAR3的半衰期为10-11天。在这类实验设置中,10-11天的半衰期是典型值。这些结果进一步证明了这些mAb 具有这类分子的典型属性。这也阐明了所述mAb具有可能比Fc-EDAl (体内半衰期短,10小时)更好的药理特性。图17-23在怀孕的小鼠体内注射抗EDAR mAb后Tabby表型的矫正。在妊娠的第 13 和 20 天(E13/E20)或妊娠的第 9 和 17 天(E9/E17),用 400 μ g 抗 EDAR mAb mAbEDAR3 处理怀孕的Tabby小鼠。在鼠仔6个月大时进行分析。为进行比较,对年龄匹配的野生型和EDA-缺乏的Tabby小鼠进行类似的分析。上述动物的正视图,尾部表型和淀粉碘汗水测试(图17),腹部外观(图18),显示耳后毛发存在的头部俯视图(图19),显示汗腺腺样结构的存在的爪垫的H&E切片(图20), 显示粘液分泌腺的用阿尔新蓝染色的气管切片(图21),显示毛囊的存在的尾部皮肤纵向和横向切片(图22),以及具有上、下臼齿的颂的图片(图。
这些图阐明了抗EDAR mAb的体内生物学活性。特别地,这些结果确定了这些mAb 的治疗活性至少与Fc-EDAl相当。此前没有报道过在i^c-EDAl治疗的Tabby小鼠体内存在功能性产粘液细胞(图21)(此结果扩展了抗EDAR单克隆抗体显示出的治疗活性范围,但这并不出人意料)。图M在新生的野生型小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的皮毛外观。在第0、4、7、 11、14天以5mg/kg的剂量向新生的野生型小鼠腹腔内注射mAbEDAR3。用PBS处理对照的同窝出生的仔鼠。在所示出的时间点给小鼠拍照。图25在新生的野生型小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的毛发形态。如图M所示,在第18天从小鼠背部和腹部取毛发,置于显微镜下拍照。右边的图示出了所显示的锯齿状和锥状部分的毛发。野生型锯齿状毛发中的扭结(kink)不再存在于经mAbEDAR3处理的小鼠中(这些毛发被称作类锯齿状)。图沈对新生的野生型小鼠的抗EDAR mAb给药不影响其体重的增加。在第0、4、7、 11、14天以lmg/kg的剂量向新生的野生型小鼠经腹膜内给予mAbEDAR3。用PBS处理对照的同窝出生的仔鼠。将体重绘制为时间的函数,并代表了每组6只小鼠的平均体重(直至 11天),每组3只小鼠的平均体重(1只雄性和2只雌性)(直至32天)和每组2只小鼠的平均体重(1只雄性和1只雌性,从第40天开始)。图27在新生的野生型小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的皮毛外观和毛发形态。 在第0、4、7、11、14天以5mg/kg的剂量向新生的野生型小鼠经腹膜内给予mAbEDARl。用PBS 处理对照的同窝出生的仔鼠。第18天对小鼠拍照。第18天收集毛发用于形态分析。图28在新生的EDA-缺乏的小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的皮毛外观和毛发形态。在第0、4、7、11、14天以5mg/kg的剂量向新生的EDA-缺乏的小鼠经腹膜内给予 mAbEDARl。用PBS处理对照的同窝出生的仔鼠。第21天对小鼠拍照。第21天收集毛发用于形态分析。EDA-缺乏的小鼠具有一种称做“中间型(intermediate)”的单一的毛发类型。图四在成年野生型小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的皮毛外观和颜色。对3周龄野生型小鼠进行背部脱毛,脱毛后立即接受单次腹膜内注射的剂量为5mg/kg的mAbEDARl。 用PBS处理对照的同窝出生的仔鼠。在所示的时间点给小鼠拍照。图30在成年野生型小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的毛发形态。如图四所示, 在脱毛后第21天,从小鼠背部的脱毛区或非脱毛区取毛发,置于显微镜下拍照。图31在成年EDA-缺乏的小鼠体内注射抗EDAR mAb后改变的皮毛外观和毛发形态。对9周龄的野生型小鼠进行背部脱毛,脱毛后立即接受单次腹膜内注射的剂量为5mg/ kg的mAbEDARl。用PBS处理对照的同窝出生的仔鼠。在所示的时间点给小鼠拍照,脱毛第 17天后用显微镜检查分析毛发形态。图32抗EDAR抗体及其Fab片段的凝胶渗透色谱洗脱谱。纯化的抗EDAR抗体 mAbEDARlUO和13不经处理或在37°C用固定化的无花果蛋白酶消化72h。在消化的抗体中,通过蛋白A色谱除去Fc片段和未经消化的抗体。浓缩含有所述Fab片段的流体,并上样于在PBS中洗脱的Superdex-200凝胶渗透色谱柱上。在^Onm处记录吸光度。以类似的方式对未经消化的抗体进行大小分馏。用mAbEDAR2、4、5、6、7、8、9、12和14得到了类似的结果(数据没有显示)。这表明可通过无花果蛋白酶消化和凝胶过滤色谱法的结合得到抗EDAR抗体的单体Fab片段。图33抗EDAR Fab片段对hEDAR-Fc的结合和解离动力学。人EDAR-Fc被捕获在 Biacore TlOO中的抗人IgG Fc-衍生的CM5芯片上。施用所示浓度的抗EDAR抗体的Fab 溶液90秒,随后用缓冲液漂洗。对mAbEDAR2、4、5、6、7、8、9、12和14的Fab片段进行类似的实验(数据没有显示)。这些数据表明抗EDAR抗体的结合常数和解离常数各自不同。图34抗EDAR抗体的重链可变区和轻链可变区的序列比较。用MacVector程序的ClustalW比对选项对抗EDAR mAb的重链可变部分和轻链可变部分的氨基酸序列进行比对。显示了不同的抗EDAR抗体之间在氨基酸水平上的一致性的百分比。图35抗EDAR抗体的特征和性质。该图总结了 mAbEDARs的一些特征最可能使用的基因、VDJ和VJ接合区处的氨基酸序列、用于免疫接种的抗原、同种型、鉴定出的表位和鉴定出的EDAR种(人和/或小鼠)。图36抗EDAR抗体的特征和性质此图总结了 mAbEDARs的物理学和生物学性质Fab片段的缔合和解离常数、Fab片段的亲合力、诱导新生的EDA-缺乏的Tabby小鼠尾部毛发形成和汗腺形成的体内活性、对 EDAR:Fas, Fas-缺乏的报告Jurkat细胞的体外活性。这些数据显示mAbEDARl_14为体内激动剂(没有测试不识别小鼠EDAR的mAbEDAR15)。这也显示出具有最小亲合常数的抗体, 尤其是具有最小解离常数的抗体与在体外活性分析中具有最强活性的抗体之间的相关性。 所有具有体外活性的抗体体内活性也很好。序列表本申请包括已通过EFS-Web提交的序列表,在此将其整体援引加入。2010年3月 29日建立的所述ASCII复本,被命名为17321PCT. txt,大小为160,961字节。分别用标准的核苷酸碱基字母缩写和氨基酸的三字母代码显示所附序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列。只显示了各个核酸序列的一条链,但其互补链应被理解为包括在对所显示的链的任意引用内。SEQ ID NO :1-84显示了 14种激动剂型抗EDAR单克隆抗体(即mAbEDAR 1、 mAbEDAR2、mAbEDAR3、mAbEDAR5、mAbEDAR6、mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDARlO、 mAbEDARl 1、mAbEDARl2、mAbEDAR13、mAbEDAR14 和 mAbEDAR15)的重链和轻链的 CDRl、CDR2 和CDR3的氨基酸序列。此外,mAbEDAR4的轻链和mAbEDAR2的轻链相同(参见表1)。SEQ ID NO :85-168显示了 14种上述的激动剂型抗EDAR单克隆抗体(即 mAbEDARl、mAbEDAR2、mAbEDAR3、mAbEDAR5、mAbEDAR6、mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、 mAbEDAR 10、mAbEDAR 11、mAbEDAR12、mAbEDAR13、mAbEDAR14 和 mAbEDARM)的重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列(参见表2)。SEQ ID NO :169-182 显示了 mAbEDARl、mAbEDAR2、mAbEDAR3、mAbEDAR5、mAbEDAR6、 mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDARlO、mAbEDARl1、mAbEDARl2、mAbEDARl3、mAbEDAR14 和mAbEDAR15的重链可变区的氨基酸序列(图3)。SEQ ID NO :183-196 显示了 mAbEDARl、mAbEDAR2 (禾口 mAbEDAR4 相同)、mAbEDAR3、 mAbEDAR5、mAbEDAR6、mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDARlO、mAbEDARl 1、mAbEDARl2、 mAbEDAR13、mAbEDAR14和mAbEDAR15的轻链可变区的氨基酸序列(图4)。
SEQ ID NO :197-210 显示了 mAbEDARl、mabEDAR2、mAbEDAR3、mAbEDAR5、mAbEDAR6、 mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDARlO、mAbEDARl1、mAbEDARl2、mAbEDARl3、mAbEDAR14 和mAbEDAR15的重链可变区的核苷酸序列(图3)。SEQ ID NO :211-224 显示了 mAbEDARl、mAbEDAR2 (禾口 mAbEDAR4 相同)、mAbEDAR3、 mAbEDAR5、mAbEDAR6、mAbEDAR7、mAbEDAR8、mAbEDAR9、mAbEDARlO、mAbEDARl 1、mAbEDARl2、 mAbEDAR13、mAbEDAR14和mAbEDAR15的轻链可变区的核苷酸序列(图4)。SEQ ID NO :225、227、2四、231、233 显示了不同的EDAR构建体的核苷酸序列 (从哺乳动物表达载体PCR3 (Invitrogen)的T7位点到Sp6位点)。SEQ ID NO 225 小鼠 EDAR(1-183)-Fe。SEQ ID NO 227 人 EDAR(1-183)-Fe。SEQ ID NO 2 全长的人 EDAR(1-448) SEQID NO 2 人 EDAR(1_72)-Fe。SEQ ID NO 231 人 EDAR(1_114)-Fe。SEQ ID NO :226、228、230、232、234 显示了由 SEQ ID NO :225、227、229、231、233编码的氨基酸序列。SEQ ID NO :235-242 显示了全长的人和小鼠EDAR以及人和小鼠EDAR片段的氨基酸序列。SEQ ID NO 235 全长的人EDAR(l-448)。SEQ ID NO 236 全长的小鼠EDAR(1-448)。 SEQ ID NO 237 :人 EDARQ9-72)。SEQ ID NO 238 :人 EDAR (71-114)。SEQ ID NO 239 :人 EDAR(29-114) SEQ ID NO 240 小鼠 EDAR(四_72)。SEQ ID NO 241 小鼠 EDAR(71-114)。 SEQ ID NO 242 小鼠 EDAIU29-114)。

可互换地使用,表示通过在α -氨基和相邻残基的羧基之间的肽键相互连接的一连串氨基酸残基。“氨基酸残基”是指本领域技术人员已知的任意氨基酸残基。其包含天然存在的氨基酸(包括例如,用三字母代码表示^13、4印^811、48 、078、6111、6111、617、圯8、116、1^11、 Lys, Met、Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val),以及稀有的和/或合成的氨基酸及其衍生物 (包括例如 Aad、Abu、Acp、Ahe、Aib、Apm、Dbu> Des、Dpm> Hyl、McLys、McVal、Nva 等)。所述氨基酸残基或其衍生物可为任意异构体,特别是任意手性的异构体,例如 L-型或D-型异构体。所谓氨基酸衍生物,在本文中我们是指在本领域中已知的任意氨基酸衍生物。例如,氨基酸衍生物包括来源于具有额外的侧链(例如烷基侧链)和/或杂原子取代的天然
氨基酸残基。术语“纯化的”不需要绝对的纯度;而是旨在作为一个相对的概念。因此,例如,纯化的激动剂型抗EDAR单克隆抗体制剂是指其中的蛋白比存在于细胞内的天然环境中的蛋白更纯的制剂。优选地,激动剂型抗EDAR单克隆抗体制剂经过纯化后,蛋白质的含量至少为制剂中总蛋白含量的50%。
本文所使用的表述“本质上纯的”是指至少50%纯的物质,优选至少90%纯的物质,更优选至少95%纯的物质,甚至更优选至少98%纯的物质和最优选99%纯的物质,或具有更高纯度的物质。本文所使用的“分离的抗体”是指本质上不含具有不同的抗原特异性的其他抗体的抗体(例如,特异性结合EDAR的分离的抗体是本质上不含特异性结合除EDAR以外的抗原的抗体)。然而,特异地结合人EDAR的表位、同种型或变体的分离的抗体可能与其他相关抗原(例如来自其他种(例如,EDAR同源种)的抗原)交叉反应。此外,分离的抗体可能本质上不含有其他细胞物质和/或化学试剂。在本发明的一个实施方式中,具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体结合成明确的组合物。本文所使用的“疾病”是指由不同原因(例如感染、遗传缺陷、或环境应力)导致的生物体部位、器官、或系统的病理状况,并以可视为同一组的体征或症状为特征。术语“受试者”是指人类患者或其他脊椎动物尤其是哺乳动物患者,包括希望利用本发明所述的方法检查或治疗的任意个体。然而,应当理解的是,“患者”并不自动地意味着存在症状或疾病。本文所使用的术语“患者”优选地是指需要治疗XLHED的人。为了治疗起见,“哺乳动物”是指被归类为哺乳动物的任意动物,包括人、家养动物和农场动物、以及动物园动物、比赛用动物或宠物动物,例如狗、马、猫、牛、猴等。优选地,所述哺乳动物为人。为了治疗起见,“脊椎动物”是指被归类为脊椎动物的任意动物,包括鸟、两栖动物和鱼。优选地,所述脊椎动物为人。“治疗”是指治疗性治疗和防范性(prophylactic)或预防性(preventive)措施。 需要治疗的对象包括已经患有所述病症的对象以及将要预防所述病症的对象。因此,本文中的待治疗的哺乳动物可能已经被诊断为患有所述病症或易患所述病症或对所述病症敏感。因此本文中的术语“治疗(treatment) ”或“治疗(treating) ”包括祛病治疗(curative treatment)、预防治疗以及缓解治疗(palliative treatment),更具体的为缓解治疗和祛病治疗。为了本发明的目的,所述“治疗(treatment)”是为了得到有益结果的方法,所述有益结果包括但不限于下列的一种或多种减缓或完全消除XLHED疾病的症状以及降低患者的死亡率。短语“药学上可接受的”是指当给予患者特别是人时,生理上可容忍的并且通常不产生过敏反应或类似的不良反应(例如胃部不适、眩晕等)的分子实体和组合物。表述“有效量”是足以达到有益效果或期望结果的量,所述有益效果或期望结果包括但不限于临床结果、预防或减弱由所述疾病产生的症状、减少治疗所述疾病所需的其他药物的剂量。可通过活性物质的一次或多次给药来给予有效量。为了本发明的目的,所述活性物质为当与EDAR相互作用时诱导生物学活性的分子组合物(EDAR调节物)。在本发明中,术语“受体”是指细胞表面上的(或细胞内部)结构,该结构选择性地接收并结合影响所述细胞活性的特定分子。术语“抗原”是指能被选择性结合剂(如抗体)结合的分子或分子的一部分,所述 “抗原”还能用于在动物体内引起能与该抗原的表位结合的抗体的产生。抗原可具有一个或多个表位。本文所使用的术语“抗体”是指免疫系统针对抗原所产生的保护生物体的蛋白质。然而,本文所使用的术语不仅包括完整的单克隆抗体,而且包括其片段、单链、其突变体、天然存在的变体、包含具有所需特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、 嵌合抗体以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任意其他改变的构型。 完整的“抗体”至少包含通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。所述重链恒定区由三个域(CH1、 CH2和OK)组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。 所述轻链恒定区由一个域(CL)组成。所述VH和VL区可进一步细分成高度可变的所谓的互补决定区(CDR),其中散布着更为保守的称为骨架区(FR)的区域。各VH和VL由三个CDRs 和四个FRs组成,从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4。所述重链和轻链的可变区包含可与抗原相互作用的结合域。所述抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子,包括各种免疫系统细胞(例如,效应细胞)和经典的补体系统的第一组分(Clq)。术语“激动剂”是指能够与受体结合并激活受体,产生药理学应答(例如收缩、松弛、分泌、酶活化等)的药物/配体/抗体。本文所使用的术语“单克隆抗体”(mAb)或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一的结合特异性及亲合性。 术语“表位”是指能特异性的结合至抗体的蛋白决定簇。表位通常由如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面基团组成,并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。短语“识别抗原的抗体”和“抗原的特异性抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。本文所使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地,“抗体部分”)是指完整抗体的保留了特异性结合抗原(例如EDAR)的能力的一个或多个片段。已经表明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段实现。结合的实例包括(i)Fab片段由VL、VH、CL和CHl 域组成的单价片段;(ii)F(ab) ‘ 2片段包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CHl域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv 片段;(ν)由 VH 域组成的 dAb 片段(Ward 等,(1989) Nature 341 :544-546);以及(vi)分离的互补决定区(CDR);和(vii)纳米抗体,包含单一可变区和两个恒定区的重链可变区。此外,虽然Fv片段的两个域(VL和VH)由不同的基因编码,但可通过合成的接头使用重组方法将它们连接,使它们能够形成单一的蛋白链,该链中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链 Fv(scFv);参见例如,Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad, k USA 85:5879-5883)。这些单链抗体也包含在所述术语抗体的“抗原结合部分”中。使用本领域技术人员已知的常规技术可得到这些抗体片段,并且采用与完整抗体相同的方式对所述片段的效用进行筛选。“片段”是指与各自的完整的或全长的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的序列(天然的)共享至少40%的氨基酸的序列。只要它们显示出与其来源的天然序列相同的性质,这些序列就能被使用。优选这些序列与各自的完整的或全长的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的序列共享超过70 %,优选超过80 %,特别是超过90 %的氨基酸长度。在本发明的激动剂型抗EDAR单克隆抗体的情况下,有用的片段包括但不限于 ⑶R区,尤其是重链或轻链的⑶R3区;重链或轻链的可变域;包含两个⑶Rs的抗体链的一部分或仅是包含两个CDRs的抗体的可变区等。合适的本发明的激动剂型抗EDAR单克隆抗体片段是免疫学上的功能性免疫球蛋白。本文所使用的术语“免疫学上的功能性免疫球蛋白片段”是指至少包含免疫球蛋白重链和轻链的⑶Rs的多肽片段。本发明的免疫学上的功能性免疫球蛋白片段能特异性结合EDAR。最优选地,所述片段特异性结合和/或调节EDAR 的生物学活性。在第一个实施方式中,本发明涉及用于生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体,或分离的单克隆抗体片段,或抗原结合部分或其片段的方法,所述方法包括以下步骤a)生产小鼠和/或人和/或脊椎动物种的EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白;b)用所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白免疫接种EDAR缺乏的小鼠;c)检测免疫接种了所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的EDAR缺乏的小鼠的血清中的抗EDAR抗体;d)生产骨髓瘤细胞和来自免疫接种了 EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的EDAR缺乏的小鼠的淋巴结细胞间的杂交瘤;e)通过下述i.的方法鉴定识别人和/或小鼠EDAR和/或来自脊椎动物种的EDAR 的激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段在如下 .和iii.方面的能力i.利用经设计用于检测所述激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、 或者抗原结合部分或其片段与人和/或小鼠EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白之间的结合的结合分析;和ii.在表达EDAR或EDAR融合蛋白的细胞或组织中诱导体外生物学应答的能力;iii.在表达EDAR或EDAR融合蛋白的生物体中诱导体内生物学应答的能力;f)基于步骤e)ii和步骤e)iii,选择生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体的杂交瘤系;g)对上述选择的杂交瘤系进行克隆和亚克隆;h)对得到的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段进行纯化。优选地,步骤a)所述的EDAR抗原为人EDAR,或小鼠EDAR,或来源于另外的哺乳动物种的EDAR,或来源于另外的脊椎动物种的EDAR。优选地,步骤a)所述的EDAR抗原为天然地表达全长的EDAR的细胞系或转染了全长的EDAR的细胞系,或所述EDAR抗原为可溶性EDAR片段,或所述EDAR抗原为EDAR的胞外域和另一种蛋白的融合蛋白,或所述EDAR抗原为病毒样颗粒的一部分。更优选地,所述EDAR抗原在与步骤b)的小鼠同系的细胞系中表达,或所述EDAR 抗原与IgG的Fc部分融合。甚至更优选地,所述EDAR抗原为与人IgGlFc部分融合的人或小鼠EDAR。作为步骤b)、c)和d)的替代,抗EDAR抗体,或其片段(如单链Fv)可通过选择由噬菌体展示在步骤a)的抗原上的抗体序列得到。优选地,步骤e)的结合分析通过应用可视化方法进行,所述可视化方法包括 ELISA、斑点杂交、Western印迹、RIA、免疫沉淀法、流式细胞术、荧光显微术、电子显微术、共聚焦显微术、测热法、等离子体共振、Ouchterlony测试、补体介导的血红细胞溶解、抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)等。更优选地,步骤e) i所述的结合分析通过直接ELISA或捕获ELISA进行。优选地,步骤e) 所述的体外生物学分析是对离体的Tabby小鼠胚胎的胚胎皮肤中的基板形成的测定(Mustonen 等,Ectodysplasin Al promotes placodal fate during early morphogenesis of ectodermal appendages, Development 131:4907-4919,2004), 对EDAR阳性细胞中的NF-κ B活化的测定,或对用嵌合的人EDAR-Fas受体和/或小鼠 EDAR-Fas受体转导的!^as-缺乏的Jurkat细胞的细胞凋亡的测定。更优选地,步骤e) 所述的体外生物学分析是对用嵌合的人EDAR-Fas受体和/ 或小鼠EDAR-Fas受体转导的!^as-缺乏的Jurkat细胞的细胞凋亡的测定。优选地,步骤e) iii所述的体内生物学分析是对新生的EDA-缺乏的Tabby小鼠给药后尾部毛发形成的测定和/或功能性汗腺形成的测定。特别地,步骤h)所述的纯化是通过蛋白A或蛋白G亲合色谱或通过蛋白L、基于抗小鼠IgG抗体的亲合色谱、离子交换、乙醇或硫酸铵沉淀等进行。用于制备免疫原和免疫接种动物的方法是本领域公知的方法(Kohler和 Milstein 1975Nature 256 :495-497 ;Brown 等 1981J Immunol127 :539-46 ;Brown 等, 1980J Biol Chem 255 :4980-83 ;Yeh 等,1976Proc Natl Acad Sci USA 76:2927-31; Yeh 等,1982Int J Cancer 29 :269-75 ;Kozbor 等,1983Immunol Today 4 72 ;Cole 等, 1985Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77—96 ; U. S. Pat. No. 4, 816, 567 ;Clackson 等,1991Nature 352 :624-628 ;Marks 等,1991J Mol Biol 222:581-597)。用于得到激动剂型抗EDAR抗体的优选实施方式之一如下a)生产人EDAR-Fc和小鼠EDAR-Fc融合蛋白。b)用人EDAR-Fc融合蛋白免疫接种0VE1B EDAR-缺乏的小鼠,并用小鼠EDAR-Fc 融合蛋白免疫接种0VE1B EDAR-缺乏的小鼠。c)检测免疫接种的EDAR-缺乏的小鼠血清中的抗EDAR抗体。d)生产骨髓瘤细胞和来自EDAR-Fc-免疫接种的EDAR-缺乏的小鼠的淋巴结细胞的杂交瘤。e)通过ELISA鉴定能特异性识别人和小鼠EDAR-Fc,而非不相干的Fc融合蛋白的感兴趣的杂交瘤。f)通过给予新生的Tabby小鼠未纯化的上清以鉴定生产激动剂型抗EDAR抗体的步骤e)的杂交瘤,并选择诱导尾部毛发形成和/或汗腺形成的杂交瘤。g)亚克隆并扩增步骤f)选择的杂交瘤,将它们转移至无血清培养基中,并利用蛋白G亲合色谱从无血清的上清中纯化抗体。通过它们在^Onm下的吸光度测定纯化的抗体的剂量。h)在用嵌合的人EDAR-Fas受体转导的!^as-缺乏的Jurkat细胞上和在用嵌合的人EDAR-Fas受体转导的!^s-缺乏的Jurkat细胞上滴定步骤g)中纯化的抗EDAR抗体。测定它们诱导细胞凋亡的EC50。i)在新生的Tabby小鼠中滴定步骤g)中纯化的抗EDAR抗体,并测定它们诱导尾部毛发形成和/或汗腺形成能力的EC50。j)选择在步骤h)和i)的测试中具有最小的EC50的抗EDAR抗体。通过该工艺获得的抗体序列为mAbEDARl-15的抗体序列(SEQ ID#169_196),优选地为 mAbEDARl、3、5、6、7、8、9、10、12、13 和 14 的序列(SEQ ID#169、171-177、179-181、183、 185、186-191 和 193-195),甚至更优选地为 mAbEDARl、3、10 和 12 的序列(SEQ ID#169、171、 177、179、183、185、191和 193)。在实施例1中阐明了优选的用于生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的方法。令人惊讶地,申请人观察到按照本发明所述的工艺得到了一些意料之外的结果。特别地,为了开发EDAl-依赖的生物学活性分析开发出了不同的细胞系 (EDAR-Fas-转导的Jurkat细胞系和!^as-阴性的Jurkat细胞系),所述分析对EDAl的多聚化形式是灵敏且特异的。因为i^as-阳性细胞会造成细胞系对EDAR激动剂具有不恰当的灵敏度,可能需要应用i^as-阴性的受体细胞系。已经发现能够在该分析中正常工作的细胞系表达低水平的转导的EDAR-Fas融合蛋白。如果细胞系的选择是基于转基因的表达完成的,可以料想人们将选择表达高水平的转基因的细胞。人们可以预见这将造成不能成功地鉴定出合适的细胞系。这些意料之外的结果现在可通过高水平的转基因甚至在缺少配体时都引起细胞凋亡来进行合理化的解释。因此这些细胞在选择前被迅速地剔除。尽管如此, 那些表达高水平EDAR-Fas融合蛋白的细胞是不灵敏的,这极有可能是因为它们具有信号通路中的突变的下游元件。另一要点在于表达EDAR-Fas的细胞允许迅速地将激动剂型抗EDAR抗体分选为两类在这些细胞中显示体外活性的抗体和在这些细胞中不显示体外活性的抗体。那些能激活表达EDAR-Fas的细胞的抗体通常也是那些具有最小亲合常数和最小解离常数的抗体。 可以预期这些抗体也是那些在牙齿发育中具有最好活性的抗体。适当的牙齿发育所需的 EDA信号,实际上被认为比其他外胚层附属部分(appendage)的发育所需的EDA信号更强或更优质(Mues 等,Eur. J. Hum. Gen. 18 19-25,2010)。第三个令人关注的要点是开发单克隆抗体的经典方法在于用人蛋白抗原免疫接种野生型小鼠。在这种情况下,得到的是特异性针对小鼠和人蛋白之间不同的决定簇的抗体。为了生产能与小鼠和人EDAR两者交叉反应的激动剂型抗EDAR单克隆抗体,申请人使用EDAR-缺乏的小鼠OVEBl (由于EDAR信号缺乏的小鼠downless和sleek仍然表达EDAR 多肽的胞外区,它们并不合适)。该方法被认为能够使申请人生产的抗EDAR抗体的多样性最大化。所述OVEBl小鼠品系不能商购得到。这种情况使得该方法对大多数想开发激动剂型抗EDAR抗体的人来说都存在问题。起初,申请人尝试通过用重组EDAl蛋白(人和小鼠之间100%相同的部分)免疫接种野生型小鼠来开发抗EDAl抗体。但没有获得有用的抗体。相反,当用EDAl免疫接种Tabby小鼠(EDA-缺乏的小鼠)时,得到了抗EDAl单克隆抗体。申请人:进一步请大家注意,在体外筛选之后,通过将所述激动剂型抗EDAR单克隆抗体注射入新生的Tabby小鼠进行体内筛选。该体内分析当然决不是本领域没有经验的科学家能够容易地进行的标准测试。本发明的另一个目的是提供通过上文记载的工艺获得的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段,其中,对Fab片段而言,所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段以至少的亲合常数(KD)结合至人和/或小鼠EDAR。本发明所述的特异性结合呈现出高亲合力。此外,实施例7中记载了 当给予新生的Tabby小鼠与小鼠 EDAR交叉反应的所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段时,诱导了尾部毛发的形成和/或汗腺的形成,并具有小于20mg/ kg 的 EC50。本文所使用的“特异性结合”是指抗体结合至预定的抗原。典型地,对Fab片段而言,所述抗体结合的亲合常数(KD)为10_8M以下,并且与预定抗原结合的KD比与除预定抗原或密切相关的抗原以外的非特异性抗原(例如,BSA,酪蛋白)结合的KD至少要低10倍。 短语“识别抗原的抗体”和“抗原的特异性抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。本文所使用的术语“Kassoc”或“Ka”是指特定的抗体-抗原相互作用的缔合速率, 而术语“KdiS”或“Kd”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。术语IgG抗体的“高亲合力”是指对Fab片段而言的亲合常数(KD)为至少约10_8M、至少约10_9M、至少约ΙΟ,Μ、 至少约10-"Μ、或至少约10 Μ或更高,例如高达10 Μ或10 Μ或更高。然而,对于其他抗体同种型而言,“高亲合力”结合可以不同。优选地,特异性结合人和小鼠EDAR的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段包含含有以下互补决定区氨基酸序列的重链可变区SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3 ;或 SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8、 SEQ ID NO :9;或 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO :15;或 SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20,SEQ ID NO :21 ;或SEQ ID NO :25,SEQ ID NO :26,SEQ ID NO :27 ;或SEQ ID NO :31、 SEQ ID NO :32,SEQ ID NO :33 ;或 SEQ ID NO :37,SEQ ID NO :38,SEQ ID NO :39 ;或 SEQ ID NO :43, SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45 ;或 SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51 ; 或 SEQ ID NO :55,SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57 ;或 SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO 63 ;或SEQ ID NO :67,SEQ ID NO :68,SEQ ID NO :69 ;或SEQ ID NO :73,SEQ ID NO :74、 SEQ ID NO 75 ;或SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :81 ;以及含有以下互补决定区氨基酸序列的轻链可变区:SEQ ID NO :4,SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 ;或SEQ ID NO =IOSEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12 ;或 SEQ ID NO :16,SEQ ID NO :17,SEQ ID NO :18 ;或 SEQ ID NO 22,SEQ ID NO :23,SEQ ID NO :24;或 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30;或 SEQ IDNO :34, SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36 ;或 SEQ ID NO :40、SEQ IDNO :41、SEQ ID NO :42 ; 或 SEQ ID NO :46, SEQ ID NO :47, SEQ IDNO :48 ;或 SEQ ID NO :52, SEQ ID NO :53, SEQ ID NO 54 ;或 SEQID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60 ;或 SEQ ID NO :64、SEQID NO :65、 SEQ ID NO 66 ;或 SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :71、SEQID NO :72 ;或 SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :77,SEQ ID NO :78 ;或 SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83,SEQ ID NO :84 ;和 / 或其组合,其中所述分离的单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段为人和小鼠EDAR的激动剂。得到的特异性结合人EDAR (mAbEDARl-15)和小鼠EDAR(mAbEDARl_14)的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的CDR氨基酸序列如表1所示。

1. 一种生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段的方法,该方法包括如下步骤a)生产小鼠和/或人和/或脊椎动物种的EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白;b)用所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白免疫接种EDAR缺乏的小鼠;c)检测免疫接种了所述EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的EDAR缺乏的小鼠的血清中的抗EDAR抗体;d)生产骨髓瘤细胞和来自免疫接种了EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白的 EDAR缺乏的小鼠的淋巴结细胞间的杂交瘤;e)通过下述i.的方法鉴定识别人EDAR和/或小鼠EDAR和/或来自脊椎动物种的 EDAR的激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段在如下ii.和iii.方面的能力1.利用经设计用于检测所述激动剂型抗EDAR抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段与人和/或小鼠EDAR抗原、或EDAR片段、或EDAR融合蛋白之间的结合的结合分析;和 .在表达EDAR或EDAR融合蛋白的细胞或组织中诱导体外生物学应答的能力;iii.在表达EDAR或EDAR融合蛋白的生物体中诱导体内生物学应答的能力;f)基于步骤e)ii和步骤e)iii,选择生产激动剂型抗EDAR单克隆抗体的杂交瘤系;g)对上述选择的杂交瘤系进行克隆和亚克隆;h)对得到的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段进行纯化。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述EDAR抗原是可溶性人EDAR-Fc融合蛋白或可溶性小鼠EDAR-Fc融合蛋白。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤e)所述的结合分析通过应用可视化方法进行,所述可视化方法包括ELISA、斑点杂交、Western印迹、RIA、免疫沉淀法、流式细胞术、荧光显微术、电子显微术、共聚焦显微术、测热法、等离子体共振、Ouchterlony测试、补体介导的血红细胞溶解、抗体依赖性细胞的细胞毒性。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤e)i所述的结合分析通过直接ELISA或捕获ELISA进行。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤e)ii所述的体外生物学分析是对用嵌合的人EDAR-Fas受体和/或小鼠EDAR-Fas受体转导的!^as-缺乏的Jurkat细胞的细胞凋亡的测定。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤e)iii所述的体内生物学分析是对新生 EDA-缺乏的Tabby小鼠给药后尾部毛发形成的测定和/或功能性汗腺形成的测定。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法,其特征在于,步骤h)所述的纯化是通过蛋白A 或蛋白G亲和色谱或通过蛋白L、基于抗小鼠IgG抗体的亲和色谱、离子交换、乙醇或硫酸铵沉淀进行。
8.通过权利要求1-7任一项所述的方法可得到的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段,其中,所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段以至少10_8M的亲和常数(KD)与人EDAR和/或小鼠EDAR结合。
9.如权利要求8所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段,所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段与人EDAR和小鼠EDAR特异性结合,并且包含含有以下互补决定区氨基酸序列的重链可变区SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 ;或 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9 ;或 SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :15;或 SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21;或 SEQ ID NO :25、SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO :27;或 SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33;或 SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38,SEQ ID NO :39 ;或 SEQ ID NO :43,SEQ ID NO :44,SEQ ID NO :45 ;或 SEQ ID NO 49,SEQ ID NO :50,SEQ ID NO :51 ;或 SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57;或 SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62,SEQ ID NO :63 ;或SEQ ID NO :67,SEQ ID NO :68,SEQ ID NO :69 ; 或 SEQ ID NO :73,SEQ ID NO :74、SEQ ID NO :75 ;或 SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO 81 ;以及含有以下互补决定区氨基酸序列的轻链可变区SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 ;或 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12 ;或 SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17,SEQ ID N0:18;或 SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID N0:24;或 SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29,SEQ ID NO 30 ;或 SEQ ID NO 34,SEQ ID NO 35,SEQ ID NO 36 ;或 SEQ ID NO 40,SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42 ;或 SEQ ID NO :46、SEQ ID NO 47,SEQ ID NO 48 ;或 SEQ IDNO 52,SEQ ID NO 53,SEQ ID NO 54 ;或 SEQ ID NO 58,SEQ ID NO 59,SEQ ID NO 60 ; 或 SEQ ID NO 64,SEQ ID NO 65、SEQ ID NO :66 ;或 SEQ ID NO 70、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO 72 ;或SEQ ID NO 76,SEQ ID NO 77,SEQ ID NO 78 ;或SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、 SEQ ID NO 84 ;和/或其组合,其中,所述分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段是人EDAR和小鼠EDAR的激动剂。
10.如权利要求8或9所述的分离的激动剂型抗EDAR单克隆抗体、或者分离的单克隆抗体片段、或者抗原结合部分或其片段,包含含有⑶R1、⑶R2、⑶R3序列的重链可变区和含有⑶R1、⑶R2、⑶R3序列的轻链可变区,其中(a)所述重链可变区的CDRl 序列包含 SEQ ID NOs :1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、.61、67、73或79及其保守修饰的氨基酸序列;(b)所述重链可变区的CDR2 序列包含 SEQ ID NOs :2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、.62、68、74或80及其保守修饰的氨基酸序列;(c)所述重链可变区的CDR3 序列包含 SEQ ID NOs :3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、.63、69、75或81及其保守修饰的氨基酸序列;(d)所述轻链可变区的CDRl序列包含选自于由下述氨基酸序列所组成的组的氨基酸序列=SEQ ID NOs :4、10、16、22、沘、34、40、46、52、58、64、

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